水稻基因靶向敲入效率增高方便育種

本報訊 中國科學(xué)院分子植物科學(xué)創(chuàng)新中心研究員朱健康團隊采用修飾后的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種片段靶向敲入和替換技術(shù)，高達近50%的靶向敲入效率將地方便植物的研究和育種。相關(guān)研究成果近日在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。

此前，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點敲除技術(shù)只能在基因組特定位點產(chǎn)生隨機插入和刪除，片段插入和替換的效率一直很低，限制了其在植物研究和育種上的應(yīng)用。因此，迫切需要建立植物基因組片段插入和替換技術(shù)體系。

朱健康研究組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾后，能增強CRISPR/Cas9引導(dǎo)的靶向敲入效率。研究團隊先后在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個啟動子，供體片段長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%。如此高的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現(xiàn)多基因靶向敲入。

研究人員預(yù)計，該技術(shù)的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規(guī)實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應(yīng)用。

同時，研究人員又巧妙地設(shè)計了一種片段替換的策略，稱之為重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復(fù)片段間的HDR頻率非常高。他們利用這一現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入目標位點，人為制造這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)TR-HDR去實現(xiàn)片段替換。采用該技術(shù)，他們在五個基因位點上實現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標簽蛋白融合，效率高達到了11.4%。這一技術(shù)突破將有助于植物學(xué)研究，農(nóng)作物定向遺傳改良的進程。

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